Der Kleine Kohlweißling Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae) ist ein Spezialist auf
glucosinolathaltigen Pflanzen. Er gehört zur Unterfamilie Pierinae die vor etwa 80 Millionen
Jahren einen Wirtswechsel von Fabales auf Brassicales vollzogen hat. Dafür war das
nitrilspezifizierende Protein (NSP) essentiell das beim Abbau der Glucosinolate im Darm zur
Nitrilbildung führt. Durch die Verstoffwechslung aromatischer Nitrile in den Raupen entsteht
Cyanid. Da in den ursprünglichen Brassicales aromatische Glucosinolate weit verbreitet waren
wird vermutet dass eine effiziente Cyanidentgiftung eine Voraussetzung für den Wirtswechsel
war. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Identifizierung und Charakterisierung von
ß-Cyanoalanin-Synthasen und Rhodanesen aus P. rapae und anderen Lepidoptera-Arten um die
mögliche Rolle der Cyanidentgiftung für den Wirtswechsel beurteilen zu können. Drei
ß-Cyanoalanin-Synthasen PrBSAS1-PrBSAS3 aus P. rapae waren bereits bekannt. Zur Untersuchung
der physiologischen Funktion dieser Enzyme sollte RNAi als Methode in P. rapae etabliert
werden. Die Analyse von Lepidoptera-Arten mit und ohne Spezialisierung auf glucosinolathaltige
Pflanzen zeigte dass ß-Cyanoalanin-Synthase-Aktivität weit verbreitet ist während
Rhodanese-Aktivität nur in wenigen Arten auftritt. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die
Identifizierung von 14 ß-Cyanoalanin-Synthasen. Die Ergebnisse der Enzymcharakterisierung und
phylogenetischen Analyse deuten darauf hin dass Lepidoptera allgemein mit einem PrBSAS2
Homolog mit einer hohen Cyanid-Affinität ausgestattet sind. Eine zweite ß-Cyanoalanin-Synthase
(PrBSAS3 Homolog) war auf Pieridae beschränkt während Pierinae zusätzlich über ein PrBSAS1
Homolog mit einer hohen Effizienz verfügten. Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse eine Rolle
der Cyanidentgiftung durch ß-Cyanoalanin-Synthasen für die Wirtspflanzenanpassung der Pieridae.
Mit den vor allem im Darm experimierten Rhodanesen Rho1 und Rho2 aus P. rapae wurden in dieser
Arbeit erstmalig Rhodanesen aus Insekten identifiziert. Die Lokalisation in Mitochondrien und
die hohe Affinität für Cyanid stützt eine Rolle von Rho1 in der Cyanidentgiftung. Rho2 hat
vermutlich eine andere Funktion. Zur Etablierung der RNAi in P. rapae wurden transient mit
RNAi-Konstrukten transformierte Pflanzen verfüttert. Die Expression des Zielgens PrNSP wurde
hierdurch um etwa 50 % vermindert dies hatte jedoch keinen Einfluss auf das Gewicht und das
Überleben der Raupen auf glucosinolathaltigen Pflanzen. Die Anwendung alternativer Ansätze wird
notwendig sein um die PrNSP-Expression vollständig zu unterbinden. The Small Cabbage White P.
rapae (Lepidoptera: Pieridae) is a specialist on glucosinolate-containing plants. It belongs
to the subfamily Pierinae which performed a host shift from Fabales to Brassicales about 80
million years ago. The nitrile-specifier protein (NSP) which leads to the formation of
nitriles upon glucosinolate breakdown in the larval gut is regarded as essential for this host
shift. Upon metabolism of aromatic nitriles in the larvae cyanide is formed. As aromatic
glucosinolates were widespread in ancient Brassicales an efficient cyanide detoxification
might have been a prerequisite for the host shift. The goal of this work was to identify
cyanide detoxification enzymes namely ß-cyanoalanine-synthases and rhodaneses from P. rapae
and other lepidopteran species to investigate the role of cyanide detoxification for the host
shift. Previous work had identified three -cyanoalanine synthases PrBSAS1-PrBSAS3 from P.
rapae. To further elucidate the physiological function of these enzymes we attempted to
establish RNAi as a method in P. rapae. Analysis of lepidopteran species with and without
specialization on glucosinolate-containing plants showed that ß-cyanoalanine-synthase-activity
is widespread while rhodanese-activity was only found in a few species. Using a PCR strategy
with degenerate primers and database information 14 ß-cyanoalanine-synthases were identified.
All investigated species possessed at least one BSAS2-homolog. In addition Pierid species
contained a BSAS3-homolog and species of the Pierinae an extra BSAS1-homolog. Characterization
of PrBSAS1-PrBSAS3 after heterologous expression in E. coli showed highest affinity for cyanide
for PrBSAS2 and highest efficiency for PrBSAS1. PrBSAS1-PrBSAS3 were expressed mainly in the
larval gut with highest expression levels for PrBSAS2. Characterization of the enzymes from
other lepidopteran species after expression in E. coli showed that all BSAS2-homologs possessed
high affinity to cyanide. As BSAS2-homologs seem to be widespread in Lepidoptera they could
play a role in the basal detoxification of cyanide. The BSAS1-homologs converted cyanide with
high efficiency which could point at a function in the detoxification of high amounts of
cyanide. Taken together these results support a role of cyanide detoxification by
ß-cyanoalanine synthases for h
